Изучение микромира под микроскопом/§5

Эта статья — часть материалов: курса Изучение микромира под микроскопом

Практика инкубации бактерий и их наблюдение

Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O₂:
1: облигатные аэробные (нуждающихся в кислороде) бактерии **в основном** собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода (Исключение микобактерии-рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны).
2: облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста).
3: факультативные бактерии собираются в основном в верхнем (окислительное фосфорилирование является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O₂ не зависят.
4: Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум — малая концентрация кислорода.
5: Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода, и равномерно распределяются по пробирке.

Используемые питательные среды

Была использована Тиогликолевая микробиологическая питательная среда, а именно Fluid Thioglycollate Medium. В сертификате указаны следующие штаммы, которые можно получить:

Staphylococcus aureus ATCC 6538 (как в аэробной среде, так и в анаэробной среде)
Escherichia coli ATCC 8739 (NC_010468) (как в аэробной среде, так и в анаэробной среде)
Bacillus subtilis ATCC 6633 (NZ_ADGS01000000) (только в анаэробной среде - избегают кислорода)
Clostridium sporogenes ATCC 19404 (только в анаэробной среде - избегают кислорода)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (только в аэробной среде - нуждаются в кислороде)
Candida albicans ATCC 10231 (грибок) (только в аэробной среде - нуждаются в кислороде)

Приготовление питательной среды

Понадобится собственно питательная среда, дистиллированная вода, спирт для спировки
Из инструментов понадобится пробирка с закручивающейся крышкой, держатель для пробирок, спиртовка, а также шприц, а лучше медицинская пипетка на 10 мл.

Работа со спиртовкой

Нам нужно будет нагреть до кипячения воду в пробирке, для полного растворения частиц порошка питательной смеси. Для этого есть соблазн использовать свечу - но это плохое решение. Пламя от свечи коптит, и пробирка становится черной. Конечно за не имением спиртовки и это выход, т.к. копоть можно затем вытереть.

Но лучше приобрести спиртовку и спирт для неё (кстати, спирт не так легко приобрести - официально он частным лицам не продается). Учитывая малый объем воды вскипятить воду в пробирке не так легко. Держа пробирку в штативе над спиртовкой, некоторое время вначале вы увидите, что верхняя часть пробирки запотела. Затем уже близко к точке кипения вы почувствуете маленькие толчки, которые могут сопровождаться звуком "лопающегося стекла". Если не принципиально 100°С, то на этом можно и закончить. Далее как увидите маленький пузырек поднимающийся вверх - кипячение началось, отодвиньте пробирку. Иначе далее после нескольких пузырьков вы можете не успеть - вода вырвется из пробирки, и все придется начинать заново.

Вначале лучше потренируйте просто на чистой воде, чтобы питательная смесь не оказалась разлитой на столе во время кипячения. В любом случае запаситесь тряпочкой.

Приготовление

Добавьте в пробирку немного порошка питательной смеси. На 1 литр нужно 30 г., соответственно на 100 мл - 3 гр., а в пробирке 10 - 20 мл. - поэтому достаточно питательной смеси на кончике ложки (используйте или лабораторную или одноразовую, чтобы выбросить после использования). Затем с помощью пипетки или шприца добавьте дистиллированную воду. Вскипятите над пламенем спиртовки. Поставьте пробирку в штатив. Инкубация может длиться от суток, до двух недель.

Более правильно, нужно еще стерилизовать, а затем поддерживать температуру около 37°С. Но это требует дополнительной аппаратуры. Стерилизовать в нашем случае не обязательно, так как мы инкубируем бактерии, а не проверяем медицинский препарат на стерильность. А вот чем выше температура тем лучше, так как бактерии лучше растут. Но в первом приближении попробуем при комнатной температуре.

Инкубация

09.09.2010 было приготовлено две пробирки
11.09.2010 в одной из пробирок сверху наблюдается органическая пленочка

Наблюдение под микроскопом

02.10.2010 В одной из пробирок, в которой образовалась биопленка - ощущается характерный запах. На самой пленке находится плесень, поэтому желательно вначале рассмотреть её в микроскоп отдельно (она часто образуется в бытовых условиях, например, можно оставить бокал с вином в теплом месте), чтобы не спутать с бактериями. Сами бактерии обнаружить было сложно даже при 1600 кратном увеличении - небольшие точки, которые немного движутся. Важно, взять жидкость из пробирки пипеткой и на предметное стекло нанести одну каплю, жидкость прозрачная, лишь немного мутная. При малом увеличении ничего не различимо. Начиная 1000 кратного увеличения можно заметить точки, медленно двигающиеся. Важно, не спутать с плавающими частичками если большая капля - это вполне возможно. Важно, затемнить максимально свет микроскопа (снизу у микроскопа есть соответствующие устройство) - будет лучше видно. Нужно убедится что движения воды нету. При 1600 кратном увеличении можно различить, что 2-3 точки (бактерии) двигаются синхронно, то немного отдаляясь друг от друга, то сталкиваясь (при 1000 кратном увеличении это слабо различимо).
Различимы два вида точек: (1) выше описанные темные точки (2) в 4-6 раз большие палочки (предположительно E. coli (длина 1-3 мкм, ширина – 0,5-0,8 мкм)), у них характерно повороты в трехмерности - положение сверху - видна слабодвижущаяся окружность (поэтому вначале можно не придать значения), но она медленно поворачиваясь превращается как бы в две окружности, а затем видна как единая палочка (нужно наблюдать 1-2 минуты, чтобы заметить).
Эти точки - это один и тот же вид бактерий - только находящиеся на разной глубине, и в разном отражении света. Если подольше понаблюдать, можно увидеть как одна превращается в другую.
Видно, что бактерии часто соприкасаются и остаются рядом на определенное время, видимо для конъюгации

Видео-ролики

E. coli под микроскопом (у меня на порядок медленнее движение (??), длина похожая, может чуть меньше)
E. coli под микроскопом (у меня не такие длинные, или разные бактерии или разница в масштабе (??))

Ссылки

Бактерии против вирусов - борьба за существование