Изучение микромира под микроскопом/§5

Материал из Викиверситета
Перейти к навигации Перейти к поиску
Эта статья — часть материалов: курса Изучение микромира под микроскопом

Практика инкубации бактерий и их наблюдение[править]

Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O2:
1: облигатные аэробные (нуждающихся в кислороде) бактерии в основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода (Исключение микобактерии-рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны).
2: облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста).
3: факультативные бактерии собираются в основном в верхнем (окислительное фосфорилирование является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O2 не зависят.
4: Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум — малая концентрация кислорода.
5: Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода, и равномерно распределяются по пробирке.

Используемые питательные среды[править]

Была использована Тиогликолевая микробиологическая питательная среда, а именно Fluid Thioglycollate Medium. В сертификате указаны следующие штаммы, которые можно получить:

  1. Staphylococcus aureus ATCC 6538 (как в аэробной среде, так и в анаэробной среде)
  2. Escherichia coli ATCC 8739 (NC_010468) (как в аэробной среде, так и в анаэробной среде)
  3. Bacillus subtilis ATCC 6633 (NZ_ADGS01000000) (только в анаэробной среде - избегают кислорода)
  4. Clostridium sporogenes ATCC 19404 (только в анаэробной среде - избегают кислорода)
  5. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (только в аэробной среде - нуждаются в кислороде)
  6. Candida albicans ATCC 10231 (грибок) (только в аэробной среде - нуждаются в кислороде)

Приготовление питательной среды[править]

  • Понадобится собственно питательная среда, дистиллированная вода, спирт для спировки
  • Из инструментов понадобится пробирка с закручивающейся крышкой, держатель для пробирок, спиртовка, а также шприц, а лучше медицинская пипетка на 10 мл.
Работа со спиртовкой

Нам нужно будет нагреть до кипячения воду в пробирке, для полного растворения частиц порошка питательной смеси. Для этого есть соблазн использовать свечу - но это плохое решение. Пламя от свечи коптит, и пробирка становится черной. Конечно за не имением спиртовки и это выход, т.к. копоть можно затем вытереть.

Но лучше приобрести спиртовку и спирт для неё (кстати, спирт не так легко приобрести - официально он частным лицам не продается). Учитывая малый объем воды вскипятить воду в пробирке не так легко. Держа пробирку в штативе над спиртовкой, некоторое время вначале вы увидите, что верхняя часть пробирки запотела. Затем уже близко к точке кипения вы почувствуете маленькие толчки, которые могут сопровождаться звуком "лопающегося стекла". Если не принципиально 100°С, то на этом можно и закончить. Далее как увидите маленький пузырек поднимающийся вверх - кипячение началось, отодвиньте пробирку. Иначе далее после нескольких пузырьков вы можете не успеть - вода вырвется из пробирки, и все придется начинать заново.

Вначале лучше потренируйте просто на чистой воде, чтобы питательная смесь не оказалась разлитой на столе во время кипячения. В любом случае запаситесь тряпочкой.

Приготовление

Добавьте в пробирку немного порошка питательной смеси. На 1 литр нужно 30 г., соответственно на 100 мл - 3 гр., а в пробирке 10 - 20 мл. - поэтому достаточно питательной смеси на кончике ложки (используйте или лабораторную или одноразовую, чтобы выбросить после использования). Затем с помощью пипетки или шприца добавьте дистиллированную воду. Вскипятите над пламенем спиртовки. Поставьте пробирку в штатив. Инкубация может длиться от суток, до двух недель.

Более правильно, нужно еще стерилизовать, а затем поддерживать температуру около 37°С. Но это требует дополнительной аппаратуры. Стерилизовать в нашем случае не обязательно, так как мы инкубируем бактерии, а не проверяем медицинский препарат на стерильность. А вот чем выше температура тем лучше, так как бактерии лучше растут. Но в первом приближении попробуем при комнатной температуре.

Инкубация[править]

  • 09.09.2010 было приготовлено две пробирки
  • 11.09.2010 в одной из пробирок сверху наблюдается органическая пленочка

Наблюдение под микроскопом[править]

  • 02.10.2010 В одной из пробирок, в которой образовалась биопленка - ощущается характерный запах. На самой пленке находится плесень, поэтому желательно вначале рассмотреть её в микроскоп отдельно (она часто образуется в бытовых условиях, например, можно оставить бокал с вином в теплом месте), чтобы не спутать с бактериями. Сами бактерии обнаружить было сложно даже при 1600 кратном увеличении - небольшие точки, которые немного движутся. Важно, взять жидкость из пробирки пипеткой и на предметное стекло нанести одну каплю, жидкость прозрачная, лишь немного мутная. При малом увеличении ничего не различимо. Начиная 1000 кратного увеличения можно заметить точки, медленно двигающиеся. Важно, не спутать с плавающими частичками если большая капля - это вполне возможно. Важно, затемнить максимально свет микроскопа (снизу у микроскопа есть соответствующие устройство) - будет лучше видно. Нужно убедится что движения воды нету. При 1600 кратном увеличении можно различить, что 2-3 точки (бактерии) двигаются синхронно, то немного отдаляясь друг от друга, то сталкиваясь (при 1000 кратном увеличении это слабо различимо).
  • Различимы два вида точек: (1) выше описанные темные точки (2) в 4-6 раз большие палочки (предположительно E. coli (длина 1-3 мкм, ширина – 0,5-0,8 мкм)), у них характерно повороты в трехмерности - положение сверху - видна слабодвижущаяся окружность (поэтому вначале можно не придать значения), но она медленно поворачиваясь превращается как бы в две окружности, а затем видна как единая палочка (нужно наблюдать 1-2 минуты, чтобы заметить).
  • Эти точки - это один и тот же вид бактерий - только находящиеся на разной глубине, и в разном отражении света. Если подольше понаблюдать, можно увидеть как одна превращается в другую.
  • Видно, что бактерии часто соприкасаются и остаются рядом на определенное время, видимо для конъюгации

Видео-ролики[править]

Ссылки[править]